В северо-западном углу братских келий помещается храм во имя святителя Николая, обозначенный снаружи одной главой. Построен в 1652 году князем Яковым Черкасским при монастырской больнице.
В подвальном этаже под Никольской церковью находились знаменитые застенки и каменные мешки, куда были сажаемы присылаемые в монастырь преступники. Здесь в продолжение 6 недель был подвергаем мучениям святой преподобный Дионисий, бывший настоятель Троице-Сергиевой обители, заточенный в Новоспасский монастырь как мнимый еретик.
При большевиках Никольский храм не закрывался дольше других. Он имел отдельный вход со стороны улицы. Богослужения в нем продолжались до 1926 года. И это было время полулегального существования монастыря в качестве приходской общины под названием "Братство во имя Преображения Господня". В 30-ые годы Никольский храм превратили в склад конфискованной мебели и картофелехранилище.